多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种多层面的生殖和心理障碍,影响全球约10%的女性,其特征是月经周期不规则,卵巢形态多囊样改变,临床或生化高雄激素血症[1]。PCOS是一种复杂的多基因疾病,受遗传和环境等因素的共同影响[2],但其确切的发病机制仍不清楚,目前临床上亦缺乏治疗PCOS的特效药物。故探索 PCOS背后的复杂机制,尤其是可能揭示新治疗靶点的细胞和分子显得尤为重要。本研究拟通过分析微阵列数据集来识别PCOS与正常样本相比的差异表达基因(differentially expressed genes, DEG),通过表达数量性状位点 (expression quantitative trait loci, eQTL) 和孟德尔随机化(mendelian randomization, MR)分析来评估这些基因与PCOS发病机制的关联和因果关系,以及运用基因本体论(gene ontology, GO)/京都基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析和基因集变异分析(gene set variation analysis, GSVA)来研究与这些DEG相关的潜在功能途径和发病机制,CIBERSORT分析评估PCOS中免疫细胞浸润的水平,以期揭示PCOS的分子基础并为新的治疗策略奠定基础。
1 资料与方法
1.1 数据收集
通过微阵列数据集分析获得与检索词“多囊卵巢综合征”、“人类”和“基因表达”匹配的基因表达数据集和临床表型数据。所有测量的基因表达数据和相应的平台探针注释文件均可从基因表达综合(gene expression omnibus, GEO)数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载。对于PCOS的数据集过滤标准包括:至少8个样本、至少4个病例和4个对照、未经化学处理或转基因的样本,以及GEO数据库中原始数据或阵列基因表达谱分析的可用性。
1.2 DEG的鉴定
使用R软件(版本4.3.3)读取并预处理数据集GSE6798、GSE8157和GSE10946以进行单个数据集校正。合并数据集,对 37个正常样本和58个PCOS样本进行批次校正和差异分析。“limma”包用于经典贝叶斯数据分析以筛选 DEG,显著性标准设定为P<0.05和logFoldChange(LogFC)>0.585;“pheatmap”包生成DEG的火山图和热图。从GEO数据库下载的基因表达矩阵和注释文件用于数据规范化和标准化的处理。使用“prcomp”函数进行主成分分析(PCA)以消除批次效应并使数据可视化,进一步评估验证和区分PCOS与健康对照样本的关键基因。
1.3 暴露数据的eQTL分析和结局数据的确定
为了识别与基因表达相关的遗传变异,我们利用来自不同群体的转录组和基因型数据进行了eQTL分析。迄今为止最广泛的eQTL数据荟萃分析由Westra等[3]进行,纳入了5311例欧洲个体的外周血eQTL数据。本研究中使用的汇总eQTL数据来自GWAS目录网站(https://gwas.mrcieu.ac.uk/)。根据关联性分析(P<1×10-5),找到与暴露因素强相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为工具变量;通过去除连锁不平衡的SNP(window size=10000,kb and r2<0.001),保留显著性最高的SNP进行后续分析;通过去除弱工具变量,去除F检验值<10的SNP。
PCOS结局数据来自GWAS摘要数据集(IEU)的遗传关联数据库(https://gwas.mrcieu.ac.uk/)。使用的GWAS ID为ebi-a-GCST90044902,涉及797例病例和140558个欧洲血统对照,包括 22981890个SNP。本研究中使用的所有GWAS摘要统计数据均可公开获取并免费下载。
1.4 GO/KEGG富集分析
使用“clusterProfiler”R包对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,以了解潜在的功能途径和致病机制。“clusterProfiler”包是一个基于本体的生物术语分类和基因簇富集分析工具,研究的筛选标准设定为P<0.05。
1.5 Lasso回归、SVM机器学习、随机森林树筛选PCOS特征基因
通过Lasso回归筛选PCOS特征基因:引用“glmnet”R包,引用差异基因的表达文件,构建Lasso回归的模型,进行交叉验证,输出筛选的PCOS特征基因。
SVM机器学习筛选PCOS特征基因:引用“e1071”R包,引用差异基因的表达文件,获取样品的分组信息,构建机器学习-支持向量机递归特征消除算法(SVM-RFE),对基因的重要性进行排序,进行交叉验证,获取交叉验证的误差,输出SVM机器学习方法得到的PCOS特征基因。
随机森林树方法筛选PCOS特征基因:引用“randomForest”R包,引用差异基因的表达文件,找出误差最小的点,获取基因重要性的评分,筛选重要性评分大于1和重要性评分最高的5个基因,输出随机森林树方法得到的PCOS特征基因。
引用前3种学习方法得到的PCOS特征基因的txt文件,引用“VennDiagram”R包,输出交集的特征基因,绘制Venn图。
1.6 MR分析验证
使用“TwoSample MR”软件包进行MR分析,采用逆方差加权法(inverse-variance weighting,IVW)研究特定基因与PCOS的关系,并采用MR-Egger截距测试、加权中位数法(weighted median, WME)、加权众数法(weighted mode, WM)、简单众数法(simple mode,SM)进行敏感性分析。使用三重标准方法识别交集的特征基因:①筛选出IVW方法中P<0.05的基因;②根据3种不同方法之间MR分析结果(odds ratio, OR值)方向的一致性进一步细化基因;③排除P<0.05且表现出多效性迹象的基因。
按照这一过程,通过交叉识别出这些与疾病相关的基因和DEG中共同表达的基因,然后对所有相交的特征基因进行MR分析,以确定他们与疾病的因果关系。该分析包括异质性检验、多效性检验和留一法敏感性分析,以评估结果的稳健性和可靠性,最后绘制散点图、森林图、漏斗图进行更直观的展示。
1.7 GSVA富集分析
GSVA分析通过转换基因表达数据,将单个基因的表达矩阵转化为特定基因集作为特征的表达矩阵,进而对基因富集结果进行量化,便于后续的统计分析。在GSVA分析中,P值<0.05被认为具有统计学意义。
1.8 免疫细胞相关性分析
采用CIBERSORT分析评估多囊卵巢综合征中22种免疫细胞的浸润水平[4],探讨PCOS特征基因与免疫细胞浸润的相关性,进一步探讨PCOS特征基因对免疫细胞的调控机制。
引用“preprocessCore”R包,通过免疫细胞浸润的算法,得到每个样品中免疫细胞的含量,根据P值对免疫细胞浸润的结果进行过滤,保留P值>0.05免疫细胞浸润结果。引用“reshape2”、“ggpubr”、“corrplot”R包,对样品进行分组(对照组和试验组),绘制柱状图和箱线图。引用“ggExtra”、“tidyverse”R包,去除对照组的样品,提取目标基因的表达量,对免疫细胞进行循环,满足条件的免疫细胞进行可视化, 绘制相关性棒棒糖图。
1.9 构建单基因的ceRNA调控网络
通过miRanda、miRDB、TargetScan3个软件预测目标基因结合的miRNA,通过spongeScan软件预测miRNA结合的lncRNA,得到网络关系文件(net.network.txt)、节点属性文件(net.node.txt)。下载并安装软件cytoscape3.10.2(https://cytoscape.org/),导入网络关系文件、节点属性文件,绘制ceRNA调控网络。
2 结果
2.1 3个GEO数据集概述
本研究从GEO数据库中获取了3个PCOS基因芯片数据集,这3个数据集共包括37例健康对照者和58例PCOS患者,有关数据集的详细信息见表1。
表1 3个 GEO 数据集的特点Tab.1 The characteristics of the three GEO datasets |
| GSE ID | 样本 | 组织 | 平台 | 试验类型 |
|---|---|---|---|---|
| GSE6798 | 16例病例和13例对照 | 肌肉 | GPL570 | 队列 |
| GSE10946 | 12例病例和11例对照 | 卵丘细胞 | GPL570 | 队列 |
| GSE8157 | 30例病例和13例对照 | 肌肉 | GPL570 | 队列 |
运用R4.3.3版本校正并合并了各自数据集中每个基因的表达值,并通过主成分分析(PCA)消除了批次效应,经过PCA分析后,数据集中的所有样本都达到了可接受的同质性,见图1。
2.2 DEGs鉴定
2.3 GO/KEGG富集分析
通过GO和KEGG分析,可以观察差异基因的富集情况。GO富集分析显示,差异基因主要影响对内质网应激的反应、神经元死亡、神经元死亡的调节、自噬调节、细胞对化学应激的反应、内源性凋亡信号通路等生物学功能。KEGG富集分析显示,差异基因主要影响脂质和动脉粥样硬化、神经退行性变等信号通路,见图4。
2.4 Lasso回归、SVM机器学习、随机森林树
通过Lasso回归得到21个PCOS疾病特征基因,SVM机器学习得到21个PCOS疾病特征基因,随机森林树得到8个PCOS疾病特征基因,3种学习方法取交集,得到交集的特征基因6个,包括DNAJC3、ASPH、TLR4、SEC24D、SGK1、AMFR,见图5。
2.5 MR分析
运用孟德尔随机化的方法验证Lasso回归、SVM机器学习、随机森林树3种方法筛选出的疾病交集特征基因,并判断这些特征基因与PCOS是否存在因果关系,最终得到一个与PCOS关系最密切的交集特征基因SEC24D。通过IVW方法得到MR分析结果的P值为0.03,OR值为1.13,提示SEC24D与PCOS存在因果关系(P<0.05),且是PCOS发生的危险因素(OR值>1),即随着SEC24D表达升高,PCOS的发病风险升高。散点图曲线从左往右为上升趋势,提示SEC24D是疾病发生的危险因素。森林图亦显示IVW分析得到SNP的综合效应值>0,提示PCOS的遗传易感性与SEC24D相关,且SEC24D是PCOS发生的危险因素。留一法敏感性分析结果未发现对因果关联估计值影响较大的SNP,表明结果具有稳健性。漏斗图发现当逐个以SNP为工具变量时,其因果关联效应的散点仍基本呈对称分布,说明结果不存在潜在偏倚。见图6。
2.6 GSVA分析
通过GSVA分析可以发现某些通路在目标基因的高低表达组之间的差异。横坐标代表T检验值,纵坐标代表通路的名称。红色线条表示RNA降解、非同源末端连接、基础转录因子、核苷酸剪切修复、泛素介导的蛋白水解等通路在SEC24D基因的高表达组中是上调的,绿色线条表示神经活性配体受体相互作用、味觉转导、鞘糖脂生物合成乳和新乳系列、原发性免疫缺陷、糖胺聚糖降解等通路在SEC24D的高表达组中是下调的,灰色线条则表示这些通路在SEC24D的高低表达组之间没有差异。见图7。
2.7 PCOS中免疫细胞浸润的评估
PCOS中共表达基因的功能和通路分析表明其与炎症和免疫过程密切相关,采用CIBERSORT算法推断免疫细胞特征,探讨PCOS中共表达基因与免疫细胞浸润的相关性。我们观察到PCOS组和对照组样本中特定免疫细胞亚型存在显著差异;与对照组相比,PCOS患者样本中性粒细胞(Neutrophils)比例明显升高(P<0.001),见图8。
2.8 绘制单基因的ceRNA调控网络
表2 miRNA结合的lncRNATab.2 LncRNAs that bind to miRNAs |
| miRNA | lncRNA | Sources |
|---|---|---|
| hsa-miR-875-3p | CDR1-AS | spongeScan |
| hsa-miR-875-3p | PCBP3-OT1 | spongeScan |
| hsa-miR-875-3p | RP11-64K12.8 | spongeScan |
| hsa-miR-875-3p | FRMPD3-AS1 | spongeScan |
| hsa-let-7d-3p | AC011718.2 | spongeScan |
| hsa-let-7d-3p | RP3-323A16.1 | spongeScan |
| hsa-miR-382-5p | MUC19 | spongeScan |
| hsa-let-7a-2-3p | AC011718.2 | spongeScan |
| hsa-miR-32-3p | TCF4-AS2 | spongeScan |
| hsa-miR-10a-5p | MEG3 | spongeScan |
| hsa-miR-124-5p | RP11-13K12.1 | spongeScan |
| hsa-miR-944 | RP5-1077H22.2 | spongeScan |
| hsa-miR-136-3p | TP73-AS1 | spongeScan |
| hsa-let-7f-2-3p | FAM230B | spongeScan |
| hsa-miR-30c-1-3p | AC011284.3 | spongeScan |
3 讨论
PCOS是一种多基因、多因素、全身性、炎症性、类固醇失调状态的自身免疫性疾病[5],影响女性的整个生命周期,严重危害全球约10%女性的生殖和身心健康,并有成为流行病的趋势。本研究旨在通过全面分析GEO数据库中的数据集、应用MR分析和评估免疫细胞浸润等,为PCOS的分子机制提供新见解,从而为未来治疗策略的制定提供参考。我们从 GEO 数据库中提取了3个PCOS微阵列数据集,其中包括58例PCOS患者和37例健康对照者样本。通过对这些数据集的深入分析,我们成功确定了可能对PCOS病理生理学至关重要的特定差异表达基因(DEG)。
本次研究共筛选得到59个显著的差异基因,包括28个上调的DEG和31个下调的DEG。为了更深入地研究基因的作用模式,运用GO和KEGG富集分析进一步探索了这些基因的潜在作用,特别是其在对内质网应激的反应、对化学应激的反应、自噬调节、内源性凋亡、脂质和动脉粥样硬化、神经退行性变等功能和信号通路中的重要性。这些分析揭示了与PCOS相关的关键生物学过程和途径,这些过程和途径与炎症、凋亡、自噬以及免疫等过程密切相关。
Lasso回归、SVM机器学习、随机森林树3种方法最终确定了6个与 PCOS相关的交集特征基因:DNAJC3、ASPH、TLR4、SEC24D、SGK1、AMFR。这些基因的表达模式为PCOS的遗传基础提供了新的见解,可能反映了疾病病理学中的关键分子变化。Wu等[6]研究发现环状RNA ASPH通过miR-375/MAP2K6轴促进PCOS中的KGN细胞增殖。SGK1基因可能参与DNA甲基化、表观遗传学等影响PCOS患者的家族遗传性,在PCOS发病中发挥重要作用[7]。关于TLR4与PCOS的研究较多,Liu等[8]发现生长素释放肽可以有效减轻体外炎症,并通过TLR4/NF-κB信号通路减弱PCOS小鼠的胰岛素抵抗和生殖异常;百令胶囊、补肾化浊方可能通过调控肠源性LPS-TLR4炎症通路、改善胰岛素抵抗等机制发挥治疗PCOS的作用[9-10]。目前尚未检索到DNAJC3、AMFR与PCOS的直接相关研究,但研究发现在小鼠中,DNAJC3缺乏会导致β细胞凋亡和高血糖症的逐渐发作,在人类中,双等位基因DNAJC3变异会导致多系统疾病,包括早发性糖尿病[11],故DNAJC3是否可能通过影响胰岛细胞功能而导致PCOS的发生发展值得深入研究挖掘。AMFR可以通过调节肺泡巨噬细胞功能在促进哮喘炎症中起着关键作用[12],推测AMFR是否可以促进PCOS中的炎症反应而成为PCOS发生发展的关键驱动因素。
将Lasso回归、SVM机器学习、随机森林树3种方法与MR分析结果进行交叉,证实了MR结果的稳健性,增强了这些基因与PCOS疾病关联的可信度。进一步的MR分析证实,SEC24D基因与PCOS存在因果关系,即SEC24D基因表达升高会增加PCOS的发病风险。SEC24D基因是SEC24家族的成员,参与外壳蛋白复合物Ⅱ(Coat Protein Complex Ⅱ,COPⅡ) 囊泡的形成,介导蛋白质从内质网到高尔基体的运输[13]。目前国内关于SEC24D的报道仅限于乳腺癌和乙肝病毒感染[14-15],国外的研究多集中在早期胚胎发育和成骨细胞[16-17],尚未有SEC24D与PCOS直接相关的报道。但有研究发现胰岛素原与COP Ⅱ囊泡货物识别成分SEC24D相关联,当SEC24D表达降低时,全细胞胰岛素原水平相应降低[18],女性患者中胰岛素原是胰岛素抵抗的主要相关因素,而胰岛素抵抗是PCOS发生的主要机制[19],所以SEC24D基因是否可以作为PCOS研究的新靶点值得深入探讨。
除了基因特异性效应之外,本研究还延伸到PCOS的免疫学层面。利用CIBERSORT算法评估了PCOS中各种免疫细胞亚群的分布,发现中性粒细胞比例明显升高,与既往研究相一致,尤其是PCOS伴有胰岛素抵抗患者中性粒细胞比例升高更为明显[20]。接着,进一步研究了PCOS靶基因SEC24D与免疫细胞浸润之间的联系,以及这些基因对免疫细胞的特定调控作用。通过免疫细胞相关性分析发现SEC24D与静息CD4记忆T细胞呈正相关,与幼稚B细胞、Treg呈负相关,Sarwar等[21]研究亦发现在SEC24D过表达的肾透明细胞癌、肺鳞状细胞癌和胃腺癌样本中,CD8+ T细胞浸润水平增加。本研究的结果与现有的PCOS研究一致,强调了免疫细胞在该疾病发展中的重要性[22],同时也为未来潜在的治疗途径提供了见解,比如通过调节特定的免疫细胞活动以期延缓PCOS的进展等[23]。
ceRNA网络是全转录组分析的核心,有助于缩小筛选范围,挖掘关键基因。本研究通过软件预测得到与SEC24D结合的miRNA共37个,lncRNA15个,从而绘制出SEC24D的ceRNA调控网络。研究显示miR-let-7d-3p是PCOS颗粒细胞中上调的关键miRNA,并通过靶向TLR4基因抑制细胞增殖[24]。孟睿等[25]发现敲低lncRNA TP73-AS1可能通过调控miR-128-3p的表达抑制卵巢颗粒细胞增殖,促进细胞凋亡,可能为PCOS患者提供新的治疗靶点。余下的miRNA和lncRNA尚未发现与PCOS直接相关的报道,故可作为今后研究的方向和靶点。本研究不仅证实了现有的理论知识,而且为 PCOS 的靶向治疗策略打开了新的大门。
本研究对PCOS进行了详细的分析,利用先进的生物信息学和统计学方法确定了关键基因和途径。免疫因素和遗传因素对于PCOS的发生发展至关重要,需重点关注DNAJC3、ASPH、TLR4、SEC24D、SGK1、AMFR等基因,尤其是SEC24D基因是PCOS发生的危险因素。本研究为PCOS复杂的分子机制提供了见解,并为新的治疗干预提供思路。然而,这些结果需要进一步验证,并考虑数据选择和分析技术固有的局限性。总体而言,本研究有助于更深入地了解 PCOS,未来仍需不断开发创新治疗方法以全面了解 PCOS复杂的病理生物学机制。